Инженерная энзимология. Механизмы инактивации ферментов

Все воздействия, приводящие к инактивации ферментов, иногда условно подразделяют на физические и химические. К физическим относят нагревание или переохлаждение, облуче­ние (у- и рентгеновское излучение), ультразвук, сорбцию на

границах раздела фаз (типа вода - воздух или жидкость -жидкость). Химическая инактивация может быть вызвана, на­пример, щелочами к кислотами, поверхностно- активны ми веще­ствами, органическими растворителями, мочевиной и гуанидин-хлоридом, некоторыми окислителями (например, кислородом или пероксидом водорода) и восстановителями (например, тиолами, ионами металлов), а также некоторыми ферментами (например, протеазами или протеинкиназами). Однако попытка классифи­цировать инактивационные процессы, основываясь на условном разделении инактивирующих воздействий на физические и хими­ческие, практически ничего не дает для понимания сути этих процессов. Так, например, под действием физического фактора (нагревания) в молекуле белка часто происходят химические изменения; окисление функциональных групп, гидролиз пептид­ных связей, С другой стороны, действие таких химических дена-турантов, как мочевина или гуанндин хлорид, как правило, вы-зывает изменения только физического состояния белка (конфор-мационные перестройки), но не меняет его химическую струк­туру.

Более информативной, с точки зрения решения стабилиза­ционной задачи, является классификация инактивационных про­цессов по молекулярным механизмам.

§ 2. Молекулярные механизмы инактивации ферментов

Еще в 40-х - - начале 50-х годов сложились основные пред­ставления о механизмах инактивации. В наиболее общем случае инактивационный процесс можно представить в виде двухстадий-ной схемы:

где N, D и 1-соответственно нативная, обратимо денатури­рованная и необратимо инактнвированная формы белка*. Первая стадия на схеме (!) чаще всего представляет собой обратимое конформационное изменение; в случае олигомерных ферментов эта стадия состоит в обратимой диссоциации на субъ­единицы. Вслед за обратимыми процессами протекают необрати­мые стадии (D-Л)< Механизмы инактивации ферментов, как правило, классифицируют, исходя из природы процессов, про­исходящих именно на второй, необратимой стадии. Кратко рас­смотрим основные ииактивационные механизмы.

Агрегация. Очень часто при длительной инкубации в растнорс при повышенной температуре, при экстремальных значениях pH t

* Термин <кнеобратимость» по ей ношению к инактивации имеет т\гт смысл, что после снятия инактиоанионншо воздействия (например, прн понижении температуры после 1фод<мжнтельн^го нагревания) фермент не втвращается h иатнвной каталитически активной информации N. Он остается в неактивной фор­ме 1 и в течение разумных времен наблюдения (часы. с\тки) ш- списобен само произвольно реактивироваться, т, е. перейти в форму N,"

в присутствии химических денатурантов белки агрегируют. На возможность такой инактивации оказывает влияние целый ряд факторов: температура, рН и т. п.; однако решающим среди них является концентрация белка. Поскольку кинетиче­ский порядок уравнения, описывающего стадию агрегации, равен или даже больше двух, то, естественно, увеличение концентрации белка приводит к увеличению скорости агрегации и размеров образующихся агрегатов, а также ускорению инактивации в целом. По этому характерному признаку (сильная зависимость скорости инактивации от концентрации фермента в растворе) можно кинетически отличить агрегацию от мономолекулярных инактивационных механизмов.

Как правило, белковые агрегаты образуются за счет слабых нековалентных взаимодействий, таких, как гидрофобные взаимо­действия, водородные связи. Однако если в молекулах белков имеются SH-группы или дополнительно к ним еще S-8-связи т то отдельные молекулы внутри агрегатов могут сшиваться ко-валентными дисульфидными мостиками. Размер и форма некова-лентных или ковалентпо-сшитых агрегатов могут изменяться в широких пределах вплоть до образования отдельной фазы - белковых осадков.

Изменение первичной структуры. Все химические процессы, приводящие к инактивации белков, можно подразделить на две группы. К первой относятся реакции разрыва пол и пептидной це-почки т ко второй - химическая модификация отдельных функ­циональных групп белка.

Гидролиз пептидных связей, протеолиз и автолиз. Не катали­тическое растепление пептидных связей проходит в очень-жест­ких условиях. Так, полного расщепления полипептидной цепи на отдельные составляющие аминокислоты добиваются лишь пу­тем длительного (многочасового) кипячения раствора белка в концентрированной соляной кислоте. В несколько более «мягких» условиях, при нагревании белковых растворов при нейтральных или слабощелочных рН и температуре 80-100°С, гидролиз пеп­тидных связей либо проходит лишь незначительно, либо его вооб­ще не наблюдается. Из всех пептидных связей наиболее лабиль­ными к высокотемпературному гидролизу, как правило, оказыва­ются те, которые образованы остатками аспарагиновой кислоты.

Однако гидролиз пептидных связей в белках может происхо­дить и при нормальных условиях - комнатной температуре, нейтральных значениях рН. Это является результатом работы протеаз - ферментов, созданных природой для деградации дру­гих белков в мягких условиях. Поскольку в любых (даже высоко-очищенных) препаратах белков могут находиться протеазы в ка­честве сопутствующих примесей, при изучении механизмов инак­тивации необходимо учитывать и возможность протеолиза. ф Другим примером протеолитической инактивации может слу­жить бактериальное заражение реакторов, содержащих фер­менты. Случайно попавшие в реактор клетки микроорганизмов

Секретируют протеазы, которые расщепляют молекулы фермента-биокатализатора, находящегося в растворе. Используя «осколки» протеолитической деградации в качестве питательной среды для роста, микроорганизмы размножаются; тем самым они, с одной стороны, «засоряют» реактор, с другой - уменьшают активность биокатализатора в растворе, т. е. инактивируют его.

Сами протеолитические ферменты способны расщеплять не только молекулы других белков, но и себе подобные- Этот про­цесс «саморасщепления» протеаз получил название автолиз а. От большинства других инактивационных механизмов (за исклю­чением агрегации) автолиз можно отличить кинетически. Дело в том, что существенной стадией при автолизе является обра­зование комплекса между двумя молекулами п роте азы; эта би­молекулярная стадия часто определяет общую скорость инакти­вации. Поэтому, если при изменении начальной концентрации протеаяы наблюдается изменение скорости инактивации* то изучаемый ннактивационный процесс с большой вероятностью представляет собой автолиз.

Окисление функциональных групп фермента. При повышен­ных температурах некоторые функциональные группы в белках, и в первую очередь SH-группы цистеина и индольные фрагменты триптофана, окисляются. В результате окисления образуются модифицированные производные аминокислот; сульфоксисоеди-нения цистеина (SOH, SCW и т. д.), продукты раскрытия ин-дольного кольца триптофана и др. В некоторых ферментах сульф-гидрильные группы, входящие в состав активного центра, обла­дают повышенной реакционной способностью и окисляются даже при комнатной температуре.

Расщепление S-S-связей в белках. Расщепление может про­исходить либо в восстановительной среде (в присутствии тиолов, других восстановленных соединений серы, например ЫагЭОз, NaACbh либо в щелочной среде при повышенной температуре. В первом случае продуктом восстановления S-S-связи является ее тиольная форма {белок -SH) либо смешанный дисульфид тиольной формы белка с восстанавливающим реагентом (белок -S-S-R; белок -S-SOr и т. п,). При щелочном расщепле­нии S-S-связей пр!оисходит более сложная цепь химических реакций. Сначала цистин гидролизуется с образованием дегидро-аланина:

i-СНг-СН<^ + ОН ~ -* ЧСН-CH^S-S~ + СН г = С

который, как нуклеофил, взаимодействует с аминогруппами остатков лизина, сульфгидрильными группами остатков цистеина, гуанидиниевыми группами остатков аргинина, образуя новые аминокислоты, соответственно, лизиноаланин, лантионин н орни-тниоаланин:

соон ч хоон

Релаксационные методы основаны на том принципе, что при быстром внешнем воздействии на систему (изменение температуры, давления, пр.) время, которое нужно системе для достижения нового равновесия (или стационарного состояния), зависит от скорости химической реакции (и иногда от скорости диффузии реагентов.

Рассмотрим простейшую реакцию комплексообразования активного центра фермента с лигандом

В начале система находится в равновесии, которое характеризуется константой равновесия K 0 =K (T 0) и соответственно равновесными концентрациями,,
. Предположим, что в системе резко меняется температураT ->T 0 +T . Это приводит к изменению константы равновесияK ->K 0 +K , которое определяется отношением

(2.50)

где H – стандартное изменение энтальпии. После этого система переходит в новое равновесное состояние:

(2.51)

(2.52)

Уравнение (2.51) нелинейно. Предположим, что отклонение от равновесия невелико и тогда

и уравнение (2.51) преобразуется в линейное дифференциальное уравнение:

Решение этого дифференциального уравнения:

Величина

(2.54)

называется временем релаксации.

2.5. Влияние температуры и pH на скорость ферментативных реакций

Влияние этих факторов на скорость элементарной химической реакции было рассмотрено в Гл.1. Особенность состоит в том, что ферментативные реакции являются сложными многостадийными реакциями (состоящие из многих элементарных реакций). Кроме того, состояние молекул фермента в растворе характеризуется набором конформеров, обратимо переходящих друг в друга. Конформационные переходы молекулы определяются в значительной степени температурой и pHраствора.

2.6. Ингибирование ферментативных реакций

Вещества, подавляющие каталитическую активность ферментов, называются ингибиторами . Различают два основных класса ингибиторов –обратимые

(2.55)

(пестициды, зарин, зоман, аспирин и др.)

и необратимые (инактиваторы )

(2.55)

(окись углерода, цианид-ион, анальгин и др.)

2.7. Инактивация ферментов

Биополимерные молекулы (ферменты) являются термодинамически неустойчивыми и, как правило, с течением времени изменяют свою структуру и свойства. В большинстве случаев процесс инактивации может быть описан как переход между двуми состояниями фермента активного E a и неактивногоE i :

(2.56) Кинетика процесса описывается соответствующим дифференциальным уравнением

(2.57)

и характеризуется постоянной времени

(2.58)

Процесс инактивации фермента может иметь различную физико-химическую природу. Наиболее общим является тепловая денатурация, представляющая собой существенную перестройку макромолекулы, изменение третичной и частично вторичной структуры.

Для целей инактивации могут быть использованы кавитационный ультразвук, радиоактивное излучение и пр.

Изменение pHтакже может привести к денатурации фермента. При каждом значенииpHбелок характеризуется соответствующим распределением зарядов (ионогенные группы). При очень низких или очень высокихpHраспределение зарядов может существенно поляризовать молекулу, приводить к появлению изомеров и необратимо конформировать ее с разрушением структуры активного центра. Например:

Денатурацию фермента вызывают и денатурирующие агенты , разрушающие вторичную структуру белка (например, мочевина), а также окислительные процессы с участием кислорода.

При изучении таких процессов важная информация получена релаксационными методами. Как правило, конформационные изменения сопровождаются изменением окружения ароматических аминокислот – тирозина и триптофана (полоса поглощения излучения на 290 нм). Это проявляется в изменении спектров поглощения и флуоресценции.

Обратимые конформационные изменения обычно идут со временем 0.1-100 мс, а необратимые – 1-1000 мин.

Пример 1. Простейшая кинетическая схема инактивации с равновесием конформеров:

(2.59)

Кинетика процесса описывается одним характеристическим временем

(2.60)

Пример 2. Инактивации подвержены оба конформера:

(2.61)

(2.62)

Пример 3. Более общий случай для системы с участиемn конформеров:

Часто ферменты в растворе образуют димеры, и в димерной форме оказываются стабильнее. Тогда наблюдается диссоциативный механизм инактивации :

(2.65)

Следующая схема отражает возможные механизмы инактивации в процессе реакции (мономолекулярная инактивация свободной формы фермента, мономолекулярная инактивация фермен-субстратного комплекса, бимолекулярная инактивация фермента субстратом, бимолекулярная инактивация фермента продуктом):

(2.66)

Дискриминация механизмов инактивации и определение кинетических характеристик реакции обычно проводится несколькими методами:

анализируя зависимость выхода продукта от концентрации фермента;

устанавливая связь степени конверсии субстрата со степенью инактивированности фермента;

проведение реакции при низких степенях конверсии субстрата и низких концентрациях фермента;

проведение реакции при больших концентрациях фермента;

предынкубация фермента с компонентами реакции;

использование интегральных уравнений реакции.

Одной из целей термической обработки является инактивация ферментов. Термическая устойчивость ферментов сравнима с устойчивостью микроорганизмов. По этой причине ферменты могут быть инактивированы с помощью тепловой обработки, как и в случае с микроорганизмами.

Во время пастеризации кислых продуктов, таких как квашенные овощи или фруктовые соки, следующие виды ферментов могут быть инактивированы: пектинметилстеараза и полигалактуроназа. Инактивация ферментов в этих продуктах более важна, чем разрушение микроорганизмов.

Некоторые виды ферментов очень термостабильны, например, теплоустойчивые ферменты, продуцируемые психрофильными бактериями. Эти ферменты (липазы и протеазы) могут ограничивать сроки хранения UHT-продуктов, таких как молоко.

Иногда интенсивность термических процессов основывается на инактивации определенных ферментов, которые называются индикаторными ферментами:

При бланшировании овощей: фермент пероксидаза (иногда каталаза или другие);

При пастеризации молока: фосфотаза или пероксидаза, эти индикаторные ферменты позволяют классифицировать молоко согласно интенсивности тепловой обработки (рисунок 2.9).

Рисунок 2.9 - Инактивация ферментов молока .

2.9 Оптимизация процессов термической обработки

Значения D и Z питательных веществ и показатели качества обычно выше, чем у микроорганизмов. Этот факт позволяет оптимизировать процесс тепловой обработки в сторону инактивации микроорганизмов и в то же время сохранения показателей качества.

Условия зависят от вида процесса, но в общем лучшие результаты дает интенсивный кратковременный тип процесса. В таблице 2.5 показаны потери витамина В 1 во время стерилизации.

Легко достичь оптимизации процесса стерилизации конвективно нагреваемых продуктов. Для жидкостей с маленькими частицами во взвешенном состоянии или без них лучшим решением является ультравысокотемпературная обработка.

Таблица 2.5 - Потери витамина В 1 во время стерилизации

2.10 Оценка значений F 0

Необходимое значение F 0 зависит от типа продукта и включает несколько факторов. Большое значение имеет рН продукта. Чем больше кислотность продукта, тем менее жестким будет режим стерилизации.

Различают 4 диапазона кислотности рН.

Помимо разрушения микроорганизмов значение рН также подразумевает:

Тепловая обработка менее интенсивная, если продукт имеет пониженную кислотность рН;

РН 4,5 имеет критическое значение: это самый низкий уровень рН, который допускает рост C.botulinum . Если значение рН больше, чем 4,5, выбранный процесс может привести к полной инактивации C.botulinum или 2,45 F 0 - 3 F 0 .

Значение рН 4,1 является самым низким для стерилизации. В диапазоне рН 4,1-4,5 применяется обработка 1 F 0 . При рН<4,1 нет необходимости проводить стерилизацию, т.к. пастеризация обеспечивает необходимый срок хранения и промышленную стерильность. Интенсивность процесса пастеризации часто определяется активностью ферментов, не микробиальной активностью.

Таблица 2.6 – Классификация консервов в соответствии с рН .

термофильные микро-организмы и харак-терные ферменты горох 6,5 молоко говяжья солонина 6,0 грибы, морковь спаржа, зеленый горошек 5,5 томатный суп 5,0 Низко- кислотные (рH=4,5-5,3) томаты абрикосы, груша 4,5 Кислотные (рН 3,7-4,5) кислото- и спорооб-разующие бактерии неспорообразующие кислотостойкие бактерии неспорообразующие кислотостойкие бактерии грибы и дрожжи персики 4,0 апельсиновый сок 3,5 Сильно кислотные (рН <3,7) повидло ягоды, квашеные овощи 3,0 лимонный сок 2,5

C точки зрения эффективности применения биокатализаторов было бы крайне заманчиво не только повысить стабильность ферментов, но и научиться возвращать активность отработанным в ходе технологического процесса ферментативным препаратам.

Практически одновременно с обнаружением феномена инактивации ферментов (начало ХХ в.) исследователи стали предпринимать попытки их реактивации. К настоящему времени накоплено довольно много положительных примеров в этом направлении. Их удобно классифицировать согласно причинам, вызывающим инактивацию.

Реактивация агрегированных белков . Ее часто удается осуществить, разрушив межмолекулярные нековалентные контакты (гидрофобные, электростатические, водородные связи). Для этого используют те же денатуранты, которые разрушают нековалентные взаимодействия в нативных белках, вызывая их обратимую денатурацию: концентрированные растворы мочевины и гуанидин хлорида‚ экстремальные значения рН и т. п.

Реактивация белков с измененной первичной структурой . Если белок потерял активность в результате химической модификации функциональных групп, то можно попытаться реактивировать его с помощью обратной химической реакции. Ферменты, инактивированные путем модификации SH-групп (например, их окислением), иногда удается реактивировать, добавляя избыток низкомолекулярного тиола или другого восстановителя.

Десорбция инактивированного белка со стенок сосуда . «Сорбционная инактивация» белков обусловлена слабыми нековалентными взаимодействиями (электрическими, гидрофобными, водородными связями) между белком и поверхностью реакционной ячейки. Реактивация в этом случае достигается за счет разрушения неспецифических взаимодействий при экстремальных значениях pH, под действием концентрированных растворов мочевины или гуанидин хлорида и других реагентов, являющихся «обратимыми денатурантами» для большинства белков.

Реактивация «необратимо денатурированного» белка . Реактивацию удается провести, руководствуясь следующей двухстадийной схемой: сначала в инактивированном белке следует разрушить все, в том числе ненативные нековалентные взаимодействия, т. е. перевести белок в развернутое состояние и уже из этого состояния попытаться свернуть его в нативную конформацию. Таким образом, в общем случае задача о реактивации какого-либо «необратимо денатурированного» фермента, по существу, свалится к решению двух задач. Во-первых, поиску условий, при которых инактивированный белок удается развернуть. Для разворачивания инактивированных белков обычно используют те же реагенты, с помощью которых нативные (неинактивированные) белки можно перевести в состояние статистического клубка. Это концентрированные растворы обратимых денатурантов (мочевины или гуанидин хлорида). Во-вторых, экспериментальному подбору условий, в которых развернутый белок успешно сворачивается в нативную (каталитически активную) конформацию. Для этой цели часто полезными оказываются эффекторы ферментативной активности (субстраты, ингибиторы, кофакторы и т. п.)‚ которые одновременно являются и эффекторами сворачивания, т. е. повышают выход реактивации фермента.

Регенерация кофакторов (коферментов)

К категории кофакторов относятся коферменты, простетические группы и ионы металлов. С технологической точки зрения наибольший интерес представляет регенерация коферментов. Коферменты - это низкомолекулярные органические соединения, которые играют роль дополнительного субстрата в функционировании многих ферментов.

При использовании систем иммобилизованных ферментов с коферментами приходится решать две задачи: собственно регенерацию кофермента и его удержание в реакционной системе. Последнее обычно осуществляется путем ковалентной иммобилизации коферментов на полимерных носителях. Для регенерации разработано несколько подходов‚ суть которых отражается следующей схемой:

Согласно этой схеме кофермент, изменяющийся в реакции с участием одного из ферментов, благодаря системе сопряженных реакции регенерирует, т.е. принимает свое первоначальное состояние. В зависимости от типа сопряженной реакции все способы регенерации коферментов можно разделить на две группы: ферментативные и неферментативные. К ферментативным относятся способы регенерации с использованием сопряженных субстратов или сопряженных ферментов. Неферментативные пути можно подразделить на химические и электрохимические.

Система регенерации ATP – это непрерывный процесс превращения АДФ в АТФ, катализаторами в котором выступают ферменты, фосфорилирующие дифосфат, используя в качестве доноров фосфата фосфатсодержащие соединения (ацетилфосфат, креатинфосфат, аргининфосфат и т.д.).

Преподаватель:
к.б.н
Кузнецова Екатерина Игоревна

Механизмы инактивации ферментов
1. Изменение первичной структуры:
1.1. Разрыв полипептидной цепи:
Жесткие условия (длительное кипячение в HCl) –
гидролиз до отдельных ам-т.
При нагревании до 100 °С (pH 7-8), гидролиз
пептидных связей незначителен.
Наиболее чувствительными к
высокотемпературному гидролизу являются
пептидные связи, образованные остатками
аспарагиновой кислоты.
Протеазы (бактериальное загрязнение, автолиз).

Решение:


инактивированных ферментов.

1.2.Окисление функциональных групп фермента
SH-группы цистеина и индольные фрагменты
триптофана, при повышенной температуре, могут
окисляться (сульфокси- соединения цистеина
(SOH, SO2H) и образовываться продукты
раскрытия индольного кольца триптофана.

Решение:
Реактивировать с помощью восстанавливающих
агентов, в частности низкомолекулярных тиолов
(например, цистеин или дитиотрейтол) .

Вызывают: Тиолы и другие восстановленные
соединений серы, например Na2SO3, Na2S2O3.
Продуктом восстановления дисульфидной связи
(S-S) является:
1) тиольная форма (белок–SH)
2) смешанный дисульфид тиольной формы белка с
восстанавливающим реагентом, например
белок–S–SO3).

1.3. Расщепление дисульфидных связей
Щелочной гидролиз цистеина →дегидроаланин→
Благодаря нуклеофильным свойствам
взаимодействует с NH2-группами лизина и SHцистеина →лизиноаланин и лантионин.
Для полной деструкции всех S–S связей требуются достаточно жесткие условия (0,1–1М щелочь,
100 °С).
Однако деструкция наиболее реакционноспособных
S–S связей может проходить в достаточно мягких
условиях – например, при температурах 60–80 °С и
слабощелочных значениях рН.
Cледует учитывать при использовании ферментов в
качестве добавок к моющим средствам.

Решение:
Добавление в среду тиолов приведет к
расщеплению смешанного дисульфида и
последующему образованию правильной S–S связи

1.4. Химическая модификация каталитических SHгрупп.
Катионы тяжелых металлов (Hg, Pb и Cu)
связываются с SH-групп активного центра
фермента
↓
Образование соответствующих меркаптидов
↓
Фермент инактивируется

10.

1.5. Фосфорилирование белков in vivo.
Под действием фосфорилазы и фосфатазы,
содержащихся в полуочищенных ферментативных
препаратах в виде примесей
↓
Фосфорная кислота связывается с ОН-группами
серина и треонина.
↓
Конформационные изменения в белковой
молекуле
↓
инактивацию фермента.

11.

Решение:
В литературе практически отсутствуют примеры
удачной реактивации подобным образом
инактивированных ферментов.

12.

1.6. Дезаминирование остатков аспарагина.
При температурах (порядка 100 °С) и рН (порядка
4,0–5,0) происходит дезаминирование остатков
аспарагина.
↓
инактивации фермента.

13.

Решение:
В литературе практически отсутствуют примеры
удачной реактивации подобным образом
инактивированных ферментов.

14.

1.7. Радиационная инактивация ферментов
γ-облучение и УФ-свет
Воздействуют на функциональные группы
ферментов, пептидные связи и SH-группы
остатков цистеина.

15.

2. Агрегация
Наблюдается при повышенной температуре, при
экстремальных значениях рН, в присутствии
некоторых химических соединений.
Чем выше концентрация, тем быстрее идет
агрегация.
Гидрофобные взаимодействия и водородные
связи, возможно образование дисульфидных
мостиков между отдельными белковыми
молекулами

16.

Решение:
Необходимо разрушить межмолекулярные
ковалентные и нековалентные контакты c
помощью концентрированных растворов
мочевины и гуанидинхлорида, экстремальных
значений рН.
Если при агрегации ферментов образовались
межмолекулярные S-S -мостики, в среду вносят в
относительно невысоких концентрациях
(мкмоль/л) тиолсодержащие реагенты (например,
цистеин или дитиотрейтол).
При таких концентрациях внутримолекулярные
S–S связи в белке, как правило, не затрагиваются.

17.

3. Инактивация ферментов поверхностным
натяжением
Поверхностное натяжение на границе раздела
между воздухом и чистой водой составляет 80
дин/см.
Пенообразование вызывает денатурацию
ферментов, адсорбированных на границе раздела
фаз.

18.

Решение:
Добавление ПАВ снижает поверхностное
натяжение до 1 дин/см.

19.

4. Сорбция белка на стенках реакционного
сосуда
Сорбция за счет нековалентных взаимодействий
приводит к уменьшению концентрации фермента в
растворе.
Необходимо учитывать при работе с
разбавленными белковыми растворами
(концентрация 10-8–10-10 моль/л).
Под влиянием денатурирующих факторов
способность белков сорбироваться на стенках
реакционного сосуда может возрастать.

20.

Решение:
Десорбция фермента со стенок реакционного
сосуда достигается за счет разрушения
неспецифических взаимодействий между
белком и сорбционными центрами на поверхности
сосуда.
Можно использовать экстремальные значения рН,
концентрированные растворы мочевины или
гуанидинхлорида.

21.

5. Диссоциация олигомерных белков на
субъединицы
Вызывают: Мочевина, детергенты, кислоты или же
нагревание.
Приводят к:
конформационным изменениям отдельных
субъединиц;
агрегации субъединиц;
диссоциации кофакторов из активных центров;
модификации функциональных групп, которые в
олигомерном белке были экранированы от
контакта с растворителем.

22.

6. Десорбция кофактора из активного центра
фермента
Вызывает: нагревание, действие хелаторов, диализ
Если диссоциация кофактора сопровождается
значительными конформационными сдвигами или
химической модификацией важных
функциональных групп → фермент
инактивируется необратимо.
Если при этом не произошло существенного
изменения белковой конформации, то добавление
в среду избытка кофактора приводит к
реактивации фермента.

23.

Регенерация кофакторов
Способы регенерации:
Ферментативный (методы с использованием сопряженных субстратов или ферментов)
Неферментативный (химические и
электрохимические подходы)

24.

Ферментативный способ

В систему вводят избыточное количество
сопряженного субстрата того же фермента:
Пример: при работе алкогольдегидрогеназы
расходуется НАДН.

25.

Ферментативный способ
1. Использование сопряженных субстратов.
Недостатка:
используются высокие концентрации
сопряженного субстрата, так как равновесие
реакции сильно сдвинуто в сторону
образования спирта;
усложняет процедуру выделения основного
продукта из реакционной смеси.

26.

Ферментативный способ
2. Использование сопряженных
ферментативных реакций
В систему, дополнительно вводят фермент 2,
функционирование которого обеспечивает
регенерацию кофермента.
Используемые в системе ферменты должны иметь
разную субстратную специфичность

27.

Неферментативные способы
1. Химические методы.
Используются дитионит натрия и некоторые
соли пиридиния:
+ Низкая стоимость.
- могут ингибировать отдельные ферменты.
Флавиновые коферменты

28.

Неферментативные способы
2. Электрохимические методы.
Прямое электрохимическое восстановление или
окисление.
“-” появления в процессе регенерации
ферментативно неактивных форм кофермента,
например в результате его димеризации.

29. СТАБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

30.

Проблемы возникающие при использовании
ферментов в биотехнологических процессах:
1. Повышенные температуры
2. Экстремальные значения pH
3. Высокие концентрации органических
растворителей или ПАВ.
4. Невозможность многократно использовать
фермент.
5. Сложность при разделении фермента от
продукта.

31.

Основные подходы для стабилизации
ферментов:
1. Добавление стабилизирующих веществ в среду,
в которой хранится фермент или проводится
ферментативная реакция.
2. Химическая модификация фермента.
3. Иммобилизация фермента.

32.

1. Субстратов или их аналогов:
Фермент-субстратный комплекс часто более
устойчив, чем свободный фермент.
Пример: Лактатдегидрогеназа в присутствии
лактата более термоустойчив.

33.

Стабилизация ферментов с помощью:
2. Органических растворителей:
Многоатомные спирты стабилизируют некоторые
ферменты за счет повышения устойчивости
внутримолекулярных водородных связей белка.
Пример: Химотрипсин в присутствии 50–90 %
глицерина более устойчив к протеолизу

34.

Стабилизация ферментов с помощью:
3. Солей:
При низких концентрациях солей (<0,1M) катионы
Са2+, Zn2+, Mn2+,Fe2+ и др. могут специфично
взаимодействовать с металлопротеинами.
Некоторые из них - кофакторы.
Са2+ способен стабилизировать третичную
структуру ряда белков благодаря образованию
ионных связей с двумя различными
аминокислотными остатками.
Пример: у α-Амилазы (из bacillus caldolyticus)
Са2+ значительно повышает термическую
устойчивость.

35.

36.

Химическая модификация фермента
1. Фермент принимает более стабильную
конформацию.
2. Введение в белок новых функциональных групп
приводит к образованию дополнительных
стабилизирующих водородных связей или солевых
мостиков.
3. При использовании неполярных соединений
усиливаются гидрофобные взаимодействия.
4. Модификация гидрофобных областей поверхности
белка гидрофильными соединениями уменьшает
площадь неблагоприятного контакта внешних
неполярных остатков с водой.
Пример: глутаровый альдегид

37.

Иммобилизация фермента позволяет:
Повысить устойчивость фермента (нагреванию,
автолизу, действию агрессивных сред и т. д)
1. Многократно использовать фермент
2. Отделять фермент от реагентов и продуктов
реакции.
3. Прерывать реакцию в нужный момент.

38.

Иммобилизованные ферменты – это препараты
ферментов, молекулы которых связаны с
носителем, сохраняя при этом полностью или
частично свои каталитические свойства.
Методы иммобилизации:
1. Химические
2. Физические

39.

Методы иммобилизации:
В качестве носителей могут применяться:
1)Органические материалы:
1.1) природные (полисахариды, белки, липиды)
1.2) синтетические полимерные носители
2) Неорганические материалы (матрицы на
основе силикагеля, глины, керамики, природных
минералов и т. д.)

40.

1) адсорбция фермента на нерастворимом носителе
в результате электростатических, гидрофобных,
вандер-ваальсовых и др. взаимодействий;

;

структуры;
4) Включение в двухфазную систему.

41.

Методы физической иммобилизации:

Достигается путем контакта водного раствора
фермента с носителем.

42.

Методы физической иммобилизации:
1)адсорбция фермента на нерастворимом носителе
Факторы влияющие на адсорбцию:
1. Удельная поверхность и пористость носителя
2. Значение рН (на не ионообменниках мах адсорбция
в изоэлектрической точке белка)
3. Ионная сила раствора (возрастание ионной силы –
десорбция фермента, но иногда обратная ситуация
“высаливание”)
4. Концентрация фермента.
5. Температура (с одной стороны денатурация, с
другой ускоренная диффузия)

43.

Методы физической иммобилизации:
1)адсорбция фермента на нерастворимом носителе
Преимущества:

2) Доступность носителей
Недостатки:
1) Недостаточная прочность связывания
2) Многие носители биодеградируемы

44.

Методы физической иммобилизации:
2) включение фермента в полупроницаемую
капсулу, в полупроницаемую мембрану

45.

Методы физической иммобилизации:
2) включение фермента в полупроницаемую
капсулу, в полупроницаемую мембрану
Преимущества:
1) Относительная простота методики
2) Защита от микроорганизмов
3) Нет диффузионных ограничений (т.к.
отношение поверхности к площади велико и
толщина мембраны невелика)
Недостатки:
1) Биодеградируемы
2) Не применим для высокомолекулярных

46.

Методы физической иммобилизации:
3) механическое включение фермента в гелевые
структуры
Фермент включается в трехмерную сетку
полимерных цепей, образующих гель.

47.

Методы физической иммобилизации:
3) механическое включение фермента в гелевые
структуры
Необходимо учитывать:
1. Соответствие размера пор размеру фермента.
2. Природа матрицы (т.к. она создает
микроокружение для фермента, может
создавать рН отличное от рН раствора и
повышать сродство субстрата к матрице, что
повышает скорость ферментативной реакции)

48.

Методы физической иммобилизации:
3) механическое включение фермента в гелевые
структуры
Преимущества:
1) Относительная простота методики
2) Повышенная механическая, химическая и
тепловая стойкость матриц.
3) Происходит стабилизация фермента
4) Фермент защищен от бактериального
повреждения
Недостатки:
1) Не применим для высокомолекулярных

49.

Методы физической иммобилизации:
4) Включение в двухфазную систему
Фермент растворим только в одной из фаз, а
продукт - в другой
Позволяет работать в высокомолекулярными
субстратами.

50.

Методы химической иммобилизации:
Образовании ковалентных связей между
ферментом и носителем.
Преимущества:
1) Высокая прочность конъюгата
2) Можно повышать стабильность фермента

51.

При иммобилизации ферментов необходимо
соблюдать следующие условия:
1. Активные группы матрицы не должны
блокировать каталитический центр фермента.
2. Иммобилизации не должны приводить к потере
активности фермента.

52.

Весьма перспективным является использование в
качестве биокатализаторов иммобилизованных
клеток.
Т.к. можно избежать:
1) дорогостоящие стадии выделения и очистки
ферментов
2) необходимости их последующей стабилизации

53.

Термозимы
Стабильны в условиях высокой температуры,
высоких концентраций солей и экстремальных
значений рН.
Гипертермофильные микроорганизмы,
встречающиеся среди Archaea и Bacteria, живут
при температурах 80–100 °С.

54.

Механизмы ответственны за термоустойчивость
ферментов у термозимов:
Между мезофильными и термофильными
версиями ферментов - высокая степень гомологии
последовательности и структуры.
Так, последовательности термостабильных
дегидрогеназ из Pyrococcus и Thermotoga на 35 и
55% соответственно идентичны
последовательности мезофильной дегидрогеназы
из Clostridium.

55.

Было обнаружено, что дегидрогеназа из Pyrococcus
furiosus (Tm == 105 °C) содержит 35 изолейцинов,
в то время как дегидрогеназы из Thermotoga
maritima (Tm = 95 °C) и Clostridium symbiosum (Tm
= 55 °C) только 21 и 20 изолейцинов
соответственно.
Термостабильные ферменты содержат меньше
глицина: Cs дегидрогеназа содержит 48 остатков
глицина, а дегидрогеназы из Tm и Pf только
39 и 34 глицина соответственно.
Больше изолейцина и меньше глицина.

56.

Возросшая термостабильность коррелирует:
1) с увеличением жесткости белковой структуры
за счет уменьшения содержания остатков
глицина,
2) с улучшением гидрофобных контактов в ядре
дегидрогеназы из Pf в результате замены валина
изолейцином. (В результате сайт-направленного
мутагенеза приводящего к замене изолейцина
на валин термостабильность мутантов
уменьшалась).

57.

Механизмы стабилизации:
минимизация доступной площади гидрофобной
поверхности белка;
оптимизация упаковки атомов белковой
молекулы (минимизация отношения
поверхность/объем);
оптимизация распределения зарядов (достигается
благодаря устранению отталкивающих
взаимодействий, а также в результате организации
взаимодействий между зарядами в своеобразную
сеть)
Уменьшение количества впадин

58.

Применение ферментов из экстремофилов
Современные технологии молекулярной биологии
и генной инженерии позволяет:
1) получать достаточные количества ферментов из
экстремофилов для их последующего
анализа и практического применения.
2)клонирование и экспрессия этих ферментов в
мезофильных организмах.

59.

Крахмал используется для производства сахаров.
Сначала процесс ведется при (95–105 °С) и при значениях
рН 6–6,5.
На следующем этапе температура снижается до 60°С и
рН=4,5.
Использование термостабильных ферментов (αамилазы, глюкоамилазы, ксилозоизомеразы),
выделенных из гипертермофилов, позволит:
1) проводить процесс в одну стадию и при одних и
тех же условиях
2) отказаться от дорогостоящих ионообменников

60.

Применение ферментов из экстремофилов:
Наиболее термостабильные α-амилазы были
обнаружены у archaea Pyrococcus woesei,
Pyrococcus furiosus, Desulfurococcus mucosus,
Pyrodictium abyssi и Staphylothermus
marinus. Гены амилазы из Pyrococcus sp. были
клонированы и экспрессированы в E.coli и Bacillus
subtilis.

61.

Применение ферментов из экстремофилов:
Протеолитические ферменты
Сериновые щелочные протеиназы широко
используются в качестве добавок к моющим
средствам.
Протеиназы из экстремофилов сохраняют
нативность при высоких температурах, в
присутствии высоких концентраций детергентов и
других денатурирующих агентов. Pyrococcus,
Thermococcus, Staphylothermus, Desulfurococcus и
Sulfolobus. Максимальную активность эти
ферменты проявляют при температурах
от 90 до 110 °С и значениях рН от 2 до 10

62.

Применение ферментов из экстремофилов:
ДНК-полимеразы
Термостабильные ДНК-полимеразы используются
в ПЦР и играют важную роль в генной инженерии.
Термостабильные полимеразы были обнаружены у
гипертермофилов Pyrococcus furiosus и Pyrococcus
litoralis, а также у термофилов Thermus aquaticus.